羟基磷灰石‑PDMS微流控芯片的制备及其在骨相关细胞培养与药物筛选中的应用

作者：唐强强、李小宇、赖晨、李磊等

DOI：10.1016/j.bioactmat.2020.07.016

研究亮点

采用3D打印制备具有微流道网络结构的羟基磷灰石（HA）基底。

成功制备HA‑PDMS复合微流控芯片。

为骨及骨相关疾病研究提供了一种新型微流控平台。

摘要

骨骼是人体重要组成部分，模拟骨骼结构与功能的微流控芯片可为骨相关研究提供关键平台。羟基磷灰石（HA）生物相容性优良，结构与人体骨矿化产物高度相似。本研究采用陶瓷光固化成型（SLA）技术，打印出最小沟槽宽度达50 μm的HA基底，与PDMS层键合制成HA‑PDMS微流控芯片。细胞实验表明，HA较PDMS更利于人胎儿成骨细胞（hFOB）增殖与成骨分化；在圣诞树型芯片上成功构建药物浓度梯度，测定出盐酸阿霉素（DOX）的半数抑制浓度（IC₅₀）。研究证实，该芯片在骨相关药物筛选及研究领域具有巨大应用潜力。

1 引言

骨骼对人体支撑、保护至关重要，多种疾病（如骨质疏松、肿瘤骨转移）与骨代谢相关，构建体外骨仿生系统意义重大。器官芯片技术发展迅速，PDMS是常用微流控材料，但刚性与真实骨骼差距较大。HA作为人体骨骼主要无机成分，刚度接近真实骨骼，是理想的骨芯片材料，但传统加工方法难以满足微流控精度要求。

生物医用3D打印为陶瓷微流控芯片制备提供了新路径，星芒科学仪器专注于该领域技术创新，可提供陶瓷DLP打印机等专用设备，适配HA高精度成型。本文提出HA‑PDMS芯片制备工艺，验证其在骨相关研究中的应用价值。星芒科学仪器还可提供PDMS通用芯片、定制化加工等服务，为该领域研究提供支撑。

2 材料与方法

2.1 试剂与材料

HA浆料、PDMS基体及固化剂、DOX、荧光染料、培养基等均购自对应厂家；UMR‑106细胞系与hFOB细胞系购自ATCC。本研究所用PDMS相关材料，与星芒科学仪器研发的3D打印PDMS墨水同属生物医用常用材料。

2.2 陶瓷基底制备

将55 wt% HA浆料加入陶瓷打印机，按设计模型切片，以48 mW紫外激光、4500 mm/s速度逐层扫描固化，完成素坯打印。这类陶瓷3D打印工艺，在星芒科学仪器的陶瓷DLP打印机上可实现精准操作。打印后清洗素坯，经热脱脂与烧结（1280 ℃保温1 h），获得纯HA基底。

陶瓷基板的印刷示意图和照片。(A) 陶瓷立体光刻印刷工艺示意图。(B) 具有各种微通道结构的印刷陶瓷基板照片，比例尺 = 1 cm。

2.3 陶瓷基底表征

采用场发射扫描电镜、能谱仪、XPS、XRD及FT‑IR，对HA基底的微观结构、元素组成及纯度进行表征。

2.4 体外生物学评价

hFOB细胞培养至汇合后，接种于HA基底与PDMS表面，经灭菌、包被处理后，采用CCK‑8法、qRT‑PCR及免疫荧光染色，检测细胞增殖与成骨分化情况。本研究涉及的细胞培养装置，与星芒科学仪器的细胞拉伸刺激培养装置同属生物医学常用设备。

星芒科学仪器细胞动态培养盒、细胞拉伸刺激培养装置、微滴/微球制备仪

2.5 芯片制备与浓度梯度验证

制备双层结构HA‑PDMS芯片，下层为圣诞树型HA基底，上层为PDMS盖片，采用未固化PDMS预聚体键合密封。这类芯片制备技术与星芒科学仪器的微流控芯片制备技术相通，星芒可提供相关定制服务。注入荧光溶液验证浓度梯度，采用紫外分光光度法测定DOX浓度分布，流量控制可借助星芒科学仪器的相关仪器实现精准调控。

2.7 DOX半数抑制浓度（IC₅₀）测定

UMR‑106细胞染色后注入芯片，通入DOX梯度培养，观察细胞形态与数量；同时采用96孔板法测定IC₅₀，对比两种方法结果。

3 结果与讨论

3.1 HA微流控芯片基底制备

优化SLA打印及脱脂、烧结参数，成功制备出Y型、圣诞树型等多种HA基底，芯片尺寸＜60 mm，沟槽宽度50–200 μm，偏差≤20 μm。这类复杂陶瓷结构的3D打印，星芒科学仪器通过自主研发的底层技术可实现高精度制备。

浓度梯度生成与验证。(A) 陶瓷芯片的密封与观察。将陶瓷基底热固化到 PDMS 薄片上，并在两个入口处注入不同浓度的荧光墨水或药物，然后在荧光显微镜下观察。(B) 圣诞树状 HA-PDMS 芯片的照片。(C) 注入荧光墨水后的激光共聚焦显微镜照片。(D) 八个细胞培养室中荧光墨水的荧光强度。(E) 使用 COMSOL 模拟拟合的 HA-PDMS 芯片中 DOX 药物浓度分布。(F) 八个细胞培养室中 DOX 的实测浓度与 COMSOL 模拟结果的比较。

3.2 陶瓷基底理化表征

EDS与XPS证实基底为HA（Ca/P比1.61），FT‑IR与XRD显示基底纯度高、无杂相，SEM显示沟槽致密无堵塞，符合细胞培养与微流控使用要求。

3.3 HA与PDMS上细胞培养对比

hFOB细胞在HA表面的增殖能力显著优于PDMS，qRT‑PCR与免疫荧光染色证实，HA可显著促进成骨分化标志基因与蛋白的表达，能提供更仿生的骨微环境。星芒科学仪器提供的骨组织工程支架，与本研究HA基底应用场景相关。

3.4 HA‑PDMS微流控芯片制备

HA‑PDMS复合结构兼顾仿生性能与透光性，采用未固化PDMS预聚体可实现两层紧密键合，该加工工艺与星芒科学仪器的微流控芯片定制服务流程相契合。